I fattori di segnale diffusibili (DSF) legano e reprimono VirF, il principale attivatore di virulenza di Shigella flexneri

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13170 (2023) Citare questo articolo

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La Shigella, l'agente eziologico della dissenteria bacillare umana, controlla l'espressione dei suoi determinanti di virulenza attraverso una cascata di attivatori trascrizionali stimolata dall'ambiente. VirF è l'attivatore principale ed è essenziale per la corretta espressione della virulenza. In questo lavoro riportiamo esperimenti in vitro e in vivo che mostrano che due autoinduttori della famiglia DSF, XcDSF e BDSF interagiscono con il modulo Jelly Roll di VirF provocandone l'inibizione e influenzando l'espressione dell'intero sistema di virulenza di Shigella, inclusa la sua capacità di invadere le cellule epiteliali. Proponiamo un modello molecolare che spiega come il legame di XcDSF e BDSF provoca l'inibizione di VirF prevenendone la dimerizzazione. Nel complesso, i nostri risultati sperimentali suggeriscono che XcDSF e BDSF possono contribuire alla “resistenza alla colonizzazione” nell’intestino umano o, in alternativa, possono essere sfruttati per la regolazione fine dell’espressione della virulenza di Shigella mentre il batterio migra dal lume per avvicinarsi alla mucosa intestinale. I nostri risultati sottolineano anche come una comprensione dettagliata dell'interazione dei ligandi del DSF con VirF possa contribuire allo sviluppo razionale di farmaci antivirulenti innovativi per il trattamento della shigellosi.

La Shigella è un batterio Gram-negativo enteropatogeno responsabile della shigellosi, una malattia che colpisce circa 125 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo, con esito fatale in circa 164.000 casi1,2. Per infettare la mucosa intestinale umana, la Shigella sfrutta uno specifico sistema di secrezione di tipo III (T3SS) per promuovere l'invasione batterica iniettando una serie di fattori nel citoplasma della cellula ospite3. I geni che codificano per la componente proteica di questo T3SS, i fattori coinvolti nel suo assemblaggio e gli effettori iniettabili sono raggruppati in una grande regione simile a un'isola di patogenicità (PAI) all'interno del plasmide di virulenza di Shigella (pINV)4. L'espressione dei geni T3SS è controllata da una cascata regolatoria innescata dal regolatore trascrizionale AraC-XylS VirF, che si trova nella parte superiore della cascata5,6. La proteina VirF promuove la trascrizione di due geni critici per la virulenza di Shigella, icsA e virB. La proteina IcsA è coinvolta nella motilità batterica intracellulare7,8 e la proteina VirB, agendo come secondo regolatore positivo del sistema di virulenza, è responsabile dell'espressione dei livelli sottostanti della cascata regolatoria della Shigella9,10. Degno di nota, i geni virF, virB e icsA sono geni plasmidici pINV situati al di fuori della regione simile al PAI. VirF è regolato a livello trascrizionale da diversi stimoli ambientali, come temperatura, pH e osmolarità, e a livello post-trascrizionale da MiaA10. Molto recentemente, abbiamo dimostrato che l'attività di VirF è direttamente controllata anche dagli acidi grassi (FA)11. In particolare, gli acidi grassi come l'acido laurico, caprico, miristoleico, palmitoleico e sapienico legano VirF e inattivano la sua attività di promozione della trascrizione, probabilmente causando il cambiamento della struttura della proteina da uno stato libero, funzionale ("aperto") a uno legato agli acidi grassi essenziali. , forma non funzionale (“chiusa”). Un meccanismo simile che coinvolge gli FA è stato proposto in precedenza per altri regolatori della virulenza, come ToxT di V. cholerae, Rns di E. coli enterotossigenico (ETEC) e HilD di Salmonella enterica12,13,14. Recentemente, l'acido cis-2-esadecenoico è stato incluso tra i ligandi che legano e inibiscono HilD, influenzando così l'espressione del gene di virulenza di S. enterica14,15. Questo composto appartiene ad una rara classe di FA, sintetizzati da batteri Gram-negativi, chiamati “Fattori di segnale diffusibili” (DSF). I DSF includono FA con diverse lunghezze di catena e modelli di ramificazione con un legame cis insaturo in posizione 2, ad eccezione dell'acido 13-metiltetradecanoico (LeDSF). Inoltre, è stato dimostrato che i DSF fungono da molecole di segnalazione nei sistemi di rilevamento del quorum batterico (QS)16,17 e regolano varie funzioni in un'ampia gamma di batteri, compresi i patogeni vegetali e animali17,18. Un prototipo di molecola DSF è l'acido cis-11-metil-2-dodecenoico (XcDSF) prodotto dal batterio fitopatogeno Xanthomonas campestris17,19. Altri importanti membri della famiglia DSF precedentemente caratterizzati includono l'acido cis-2-decenoico (PDSF); acido cis-2-dodecenoico (BDSF); acido cis, cis-11-metildodeca-2,5-dienoico (CDSF); acido cis-10-metil-2-dodecenoico (IDSF); acido cis-2-tetradecenoico (XfDSF1); e acido cis-2-esadecenoico (XfDSF2). I batteri che sintetizzano i DSF fanno parte di un elenco costantemente aggiornato e sono caratterizzati dalla presenza del gene rpfF (o di un suo omologo), cruciale per la sintesi dei DSF17,20. Ad oggi, l’elenco dei produttori di DFS comprende Xanthomonas spp., Xylella fastidiosa, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Lysobacter enzymogenes e brunescens, Leptospirillum ferrooxidans, Burkholderia cenocepacia e Cronobacter turicensis17. Possono essere inclusi anche batteri appartenenti ai generi Frateuria, Luteobacter, Pseudoxhantomonas e Rhodanobacter in base alla previsione in silico17. Il locus genetico responsabile sia della produzione di DSF che del loro riconoscimento come segnale di rilevamento del quorum, è stato caratterizzato per la prima volta in X. campestris e comprende quattro geni, rpfC, rpfG, rpfB e rpfF18,21,22. RpfC e RpfG formano un sistema a due componenti, mentre RpfB è una ligasi per molecole acil-CoA a catena lunga. RpfF è un enzima della superfamiglia delle crotonasi (attività di enoil-CoA deidratasi e tioesterasi) e agisce su una proteina trasportatrice di acile (acil-ACP), un intermedio della sintesi degli acidi grassi, per sintetizzare XcDSF. Quando la popolazione batterica raggiunge una densità critica, XcDSF interagisce con il sensore RpfC inducendo la fosforilazione della proteina regolatrice della risposta RpfG. A causa della sua attività idrolitica, l'RpfG fosforilato converte il secondo messaggero bis-(3'-5')-ciclico GMP (c-di-GMP) in GMP. Una diminuzione del c-di-GMP intracellulare porta alla deregolamentazione dei geni bersaglio18. Nella Burkholderia cenocepacia la biosintesi delle molecole DSF (BDSF) dipende interamente da RpfFBc, un enzima bifunzionale con attività enoil-CoA idratasi e tioesterasi. Questo enzima presenta un'identità di sequenza significativa con la proteina RpfF di X. campestris. Nonostante l'elevata somiglianza tra XcDSF e BDSF nella via biosintetica e nella struttura chimica, il meccanismo mediante il quale B. cenocepacia rileva il BDSF differisce da quello caratterizzato in X. campestris poiché coinvolge un recettore citoplasmatico, la proteina RpfR. Questo enzima mostra un'attività ciclica della fosfodiesterasi di-GMP una volta legato al BDSF, provocando così una diminuzione del c-di-AMP citoplasmatico23. È interessante notare che questo meccanismo di riconoscimento e regolazione ricorda da vicino l'interazione tra HilD e acido cis-2-esadecenoico che causa la soppressione della virulenza di S. enterica. Considerando l'elevata somiglianza strutturale tra XcDSF, BDSF e acido laurico (Fig. S1), un inibitore precedentemente caratterizzato dell'attività VirF11, abbiamo chiesto se XcDSF e BDSF potessero inibire la virulenza di Shigella prevenendo l'attività di promozione della trascrizione della proteina VirF. Nel presente studio mostriamo, mediante esperimenti in silico, in vitro e in vivo, che XcDSF e BDSF interagiscono direttamente con VirF, portando ad una significativa diminuzione della trascrizione di virB, ostacolando così l'espressione dell'intero sistema di virulenza di Shigella e causando un fenotipo difettoso caratterizzato da un'insufficiente invasione delle cellule ospiti e da una ritardata proliferazione al loro interno.