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Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 282 (2023) Citare questo articolo

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La leishmaniosi è una malattia zoonotica endemica nella regione mediterranea dove Leishmania infantum è l’agente eziologico dell’infezione umana e canina. La caratterizzazione di questo parassita a livello di sottospecie può essere utile negli studi epidemiologici, per valutare il decorso clinico della malattia (ad esempio ceppi resistenti, forme viscerali e cutanee di leishmaniosi) nonché per identificare serbatoi di infezione. L'elettroforesi enzimatica multilocus (MLEE), un metodo attualmente riconosciuto come metodo di riferimento per la caratterizzazione e l'identificazione dei ceppi di Leishmania, è complicato, richiede molto tempo e richiede parassiti in coltura. Questi svantaggi hanno portato allo sviluppo di altri metodi, come la tipizzazione microsatellitare multilocus (MLMT) e la tipizzazione sequenziale multilocus (MLST), per la tipizzazione dei parassiti Leishmania; tuttavia, questi metodi non sono ancora stati applicati per l’uso di routine. In questo studio, abbiamo utilizzato innanzitutto MLST per identificare polimorfismi informativi su geni a copia singola che codificano per enzimi metabolici, in seguito ai quali abbiamo sviluppato due test di genotipizzazione rapida basati sull'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) per esplorare questi polimorfismi nei parassiti L. infantum.

È stato progettato un pannello di sequenziamento personalizzato mirato a 14 geni housekeeping ed è stata eseguita l'analisi MLST su nove ceppi/isolati canini e umani di L. infantum. Sono stati progettati due test quantitativi PCR-HRM in tempo reale per analizzare due polimorfismi informativi sui geni dell'enzima malico (ME) e della glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) (390T/G e 1831A/G, rispettivamente). I due test sono stati applicati a 73 campioni clinici/isolati provenienti dall'Italia centro/meridionale e dall'isola di Pantelleria, e i risultati sono stati confermati mediante sequenziamento del DNA in un sottogruppo di campioni.

L'analisi MLST, insieme alle sequenze disponibili nel database Genbank, ha consentito l'identificazione di due polimorfismi informativi sui geni codificanti per ME e GPI. Il rapido screening di questi polimorfismi utilizzando due test basati sulla gestione delle risorse umane in 73 campioni/isolati clinici ha portato all'identificazione di sette genotipi. Nel complesso, il genotipo 1 (tipo di sequenza 390T/1831G) è stato il più rappresentato (45,2%) nel campione complessivo ed è correlato con gli zymodemi di L. infantum più comuni (MON-1, MON-72). È interessante notare che nell'isola di Pantelleria il genotipo più diffuso (70,6%) era il genotipo 6 (tipo sequenza 390T/1831A).

L’applicazione dei nostri test HRM su campioni clinici ci ha permesso di identificare sette diversi genotipi senza la necessità di isolamento e coltivazione del parassita. Abbiamo dimostrato che questi test potrebbero essere utilizzati come strumenti rapidi, di routine ed economici per la sorveglianza epidemiologica di L. infantum o per l'identificazione di nuovi serbatoi di infezione.

La leishmaniosi è una malattia zoonotica endemica del bacino del Mediterraneo causata principalmente da Leishmania infantum, l'agente eziologico della leishmaniosi cutanea e viscerale umana (rispettivamente CL e VL), nonché della leishmaniosi canina (CanL). La caratterizzazione della Leishmania viene tradizionalmente eseguita mediante elettroforesi enzimatica multilocus (MLEE), che attualmente è ancora considerata dall’OMS il metodo di riferimento per la tipizzazione dei parassiti [1]. MLEE, sviluppato presso il Centro per la Leishmaniosi di Montpellier (Francia) (sistema MON), si basa sulle diverse mobilità elettroforetiche di 15 enzimi metabolici: malato deidrogenasi (MDH), enzima malico (ME), isocitrato deidrogenasi (ICD), 6-fosfogluconato deidrogenasi (PGD), glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD), glutammato deidrogenasi (GLUD), NADH diaforasi (DIA), purina nucleoside fosforilasi 1 (NP1), purina nucleoside fosforilasi 2 (NP2), glutammato-ossalacetato transaminasi 1 e 2 (GOT1, GOT2), fosfoglucomutasi (PGM), fumarato idratasi (FH), mannosio-fosfato isomerasi (MPI) e glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) [2]. Il confronto della mobilità dell'isoenzima con un ceppo di riferimento ha portato all'identificazione di > 300 zimodemi, tutti indicati utilizzando i termini MON. Per quanto riguarda L. infantum sono stati identificati 45 zimodemi. VL zoonotica e CanL sono causate principalmente da MON-1, MON-24, MON-34, MON-72, MON-77, MON-80, MON-98, MON-105, MON-108, MON-199 e MON -199 variante NP1130 e MON-281. In particolare, MON-1 è lo zymodema più frequente nell’uomo e nel cane [3, 4], seguito da MON-72, che è più diffuso nella CanL ma che è stato identificato anche nei pazienti umani [5]. Al contrario, alcuni zimodemi (vale a dire MON-11, MON-27, MON-28, MON-29, MON-33, MON-189) sono stati isolati solo nell'uomo [6]. Inoltre, diversi parassiti non MON-1 sono stati segnalati in pazienti con HIV [7]. Questi risultati mettono in discussione il ruolo dei cani, storicamente considerati il ​​principale serbatoio di infezione per l’uomo, nella trasmissione della malattia. Infatti, l’omogeneità degli zimodemi identificati nella popolazione canina non riflette l’eterogeneità di quelli riscontrati nell’uomo.