Sviluppo di non

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 11791 (2023) Citare questo articolo

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In questo studio è stata sviluppata l’amplificazione isotermica mediata da loop SalivaDirect non controllata elettricamente (NEC-SD-LAMP), in grado di rilevare infezioni amplificando l’espressione del DNA virale nella saliva senza utilizzare sistemi di controllo elettrico. Con questo metodo, aggiungendo solo acqua al dispositivo, il DNA virale è stato estratto dalla saliva utilizzando SalivaDirect, il DNA estratto è stato amplificato tramite amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) e i risultati sono stati confermati visivamente. La fusione dell'acido palmitico ha mantenuto la temperatura ottimale per la reazione LAMP, poiché la temperatura dell'acido palmitico è mantenuta a 62,9 °C, il suo punto di fusione. Sfruttando la vicinanza del punto di fusione alla temperatura ottimale per LAMP, LAMP può essere eseguito senza elettricità. Utilizzando questo metodo abbiamo rilevato diversi virus nella saliva. NEC-SD-LAMP ha potuto distinguere chiaramente 3 tipi di DNA virale, indicando l'elevata specificità di questa reazione. Inoltre, il limite di rilevamento della concentrazione virale del dispositivo era di 2 copie per µL, indicando che è possibile rilevare infezioni virali del DNA nella saliva anche prima della comparsa dell'infezione virale.

Le malattie infettive sono le principali cause di morte nei paesi in via di sviluppo1,2. Uno dei motivi è la mancanza di tecniche diagnostiche per gli agenti infettivi. Una causa più grave è la difficoltà di accesso a strutture mediche adeguate3. Ciò riduce le opportunità di test, che sono importanti per la diagnosi delle infezioni virali. La diagnosi precoce e il trattamento delle infezioni virali sono fondamentali per la guarigione completa e la prevenzione della loro diffusione. Inoltre, le malattie infettive, come le malattie tropicali trascurate, sono prevalenti in molte aree tropicali non elettrificate, rendendo impossibile l’installazione di dispositivi di test convenzionali che richiedono controllo elettrico, quindi sono importanti le tecniche diagnostiche che non richiedono né infrastrutture elettriche né una tensione stabile4. Pertanto, per fornire tecnologia di test ai paesi in via di sviluppo, è essenziale stabilire metodi che soddisfino i seguenti tre criteri: (1) l'intero processo dal test alla conferma dei risultati può essere eseguito senza utilizzare sistemi di controllo elettrici, (2) rilevamento accurato di malattie infettive fin dalla fase iniziale e (3) facilità d'uso e portabilità che consente di effettuare test ovunque, ad esempio in aree residenziali o all'aperto, nelle regioni tropicali o fredde (test point-of-care [POCT])5.

Diversi dispositivi o metodi possono essere utilizzati per eseguire test sulle malattie infettive in ambienti non elettrificati. Innanzitutto, esistono kit per test delle infezioni basati su reazioni antigene-anticorpo, come l’immunocromatografia6,7. Aggiungendo campioni al kit, è possibile eseguire rapidamente un test diagnostico per malattie infettive e i risultati possono essere osservati visivamente o utilizzando uno smartphone. Sebbene questi dispositivi possano eseguire facilmente i test, rilevare le infezioni nelle fasi iniziali di una malattia è difficile a causa dei metodi di rilevamento delle proteine ​​utilizzati da questi dispositivi. Gli acidi nucleici possono essere amplificati in modo efficiente mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) o l’amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) e sono efficaci nel rilevare l’infezione in una fase precoce.

LAMP è un metodo di amplificazione genica isotermica in cui i risultati possono essere osservati visivamente8,9,10. Questo metodo amplifica e rileva il gene bersaglio riscaldando il campione a una temperatura costante di 60–65 °C. LAMP utilizza quattro o sei primer durante l'amplificazione, che hanno un'elevata specificità per il gene bersaglio. Quando il gene bersaglio viene amplificato dalla LAMP, vengono prodotti ioni pirofosfato. Gli ioni pirofosfato catturano gli ioni manganese contenuti nel complesso ione calceina-manganese nel campione LAMP, rendendo luminescente la calceina. Di conseguenza, la presenza o l'assenza del gene bersaglio può essere osservata visivamente dal cambiamento di colore del campione11. Da quanto sopra, LAMP ha un'elevata specificità e sensibilità di rilevamento, nonché PCR in tempo reale e qRT-PCR12,13, che sono i metodi gold standard per il rilevamento virale. LAMP è un metodo facile da usare per il rilevamento virale rispetto alla PCR in quanto la reazione può essere eseguita con un semplice controllo della temperatura e i risultati possono essere confermati visivamente.