Generazione di un virus Saffold ricombinante che esprime UnaG come marcatore per la visualizzazione dell'infezione virale

Virology Journal volume 20, numero articolo: 175 (2023) Citare questo articolo

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Il virus del cartamo (SAFV), che appartiene al genere Cardiovirus della famiglia Picornaviridae, è associato a malattie acute respiratorie o gastrointestinali nei bambini; si sospetta inoltre che possa causare malattie gravi, come la paralisi flaccida acuta e la meningite asettica. Tuttavia, la comprensione del meccanismo della sua patogenicità è ancora limitata a causa delle numerose incognite sul suo ciclo vitale; per esempio, resta da determinare il recettore cellulare per la sua infezione. Per accelerare la ricerca sul SAFV è necessario un sistema per monitorare l’infezione da SAFV in vitro e in vivo.

Abbiamo generato un SAFV ricombinante che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) o UnaG, una nuova proteina fluorescente derivata dall'anguilla giapponese. Le cellule HeLa infettate da SAFV che esprime GFP o UnaG hanno mostrato un segnale fluorescente verde brillante, consentendo un comodo monitoraggio dell'infezione da SAFV. Tuttavia, l'espressione di GFP ma non di UnaG è stata rapidamente persa durante il passaggio del virus a causa della differenza nella stabilità genetica nel genoma del virus SAFV; il gene UnaG è stato mantenuto stabilmente nel genoma del virus dopo almeno cinque passaggi.

L'infezione da SAFV delle cellule in coltura può essere facilmente monitorata utilizzando SAFV che esprime UnaG, che è superiore a GFP in termini di stabilità genetica nel genoma del virus. Questo virus potrebbe essere uno strumento utile per la ricerca sul SAFV, ad esempio confrontando la suscettibilità di varie cellule all'infezione da SAFV e valutando gli effetti degli antivirali sull'infezione da SAFV nello screening ad alto rendimento.

Il virus Saffold (SAFV) appartiene al genere Cardiovirus della famiglia Picornaviridae, che è una particella piccola, priva di involucro e icosaedrica con un genoma di RNA a filamento singolo con senso positivo. Il SAFV è stato scoperto come il primo cardiovirus umano nel 2007 nelle feci di un bambino che presentava febbre di origine sconosciuta nel 1981 [1]. Da allora, è stato segnalato il rilevamento di SAFV in bambini affetti da malattie respiratorie o gastrointestinali acute [2,3,4,5,6]. Inoltre, SAFV sono stati rilevati in campioni di pazienti con malattie gravi (ad esempio, paralisi flaccida acuta, meningite asettica, miocardite, pancreatite acuta e cerebellite) [7,8,9,10,11]. Tuttavia, la patogenicità del SAFV, che provoca una serie di sintomi da lievi a gravi, rimane poco chiara. L'uso di un SAFV ricombinante che ospita un gene reporter, come la proteina fluorescente verde (GFP), che consente un monitoraggio conveniente e in tempo reale della replicazione di SAFV in vitro e in vivo, sarebbe molto utile per chiarire il meccanismo della patogenicità del SAFV.

Il genoma SAFV è costituito da una lunga cornice di lettura aperta (ORF), regioni non tradotte 5' e 3' (UTR) e una coda di poli (A) di lunghezza variabile al 3' UTR. L'ORF codifica una proteina leader (L), quattro proteine ​​del capside (da VP1 a VP4) e sette proteine ​​non strutturali (2 A, 2B, 2 C, 3 A, 3B, 3 C e 3D) [1]. La poliproteina viene tradotta dall'ORF e quindi elaborata dalla proteasi 3 C in proteine ​​virali mature post-traduzionali, mentre la separazione co-traduzionale della poliproteina avviene nel motivo StopGo. Questo motivo è l'oligopeptide D(V/I) ExNPG|P (dove “|” rappresenta la giunzione tra 2 A e 2B) che media il processo StopGo [12, 13], ed è conservato nella giunzione 2 A/2B di SAFV (DIETNPG|P) [14]. Il processo StopGo è stato chiamato anche “salto ribosomiale” o “Stop-Carry On” e impedisce la formazione di un legame peptidico tra glicina e prolina, ma consente la continuazione della traduzione.

Per far avanzare gli studi patogenetici molecolari di SAFV utilizzando la genetica inversa, abbiamo precedentemente creato un clone di cDNA infettivo di SAFV-3 (il ceppo JPN08-404) [8]. Nel presente studio, sulla base di questo clone di cDNA, abbiamo generato due SAFV ricombinanti che esprimono un gene reporter, GFP o UnaG, per rilevare prontamente l'infezione nelle cellule viventi inserendole tra 2 A e 2B utilizzando il motivo StopGo. UnaG è una nuova proteina fluorescente verde derivata dall'anguilla giapponese [15] che, con 139 aminoacidi, è di dimensioni più piccole rispetto alla GFP (239 aminoacidi). Nel presente studio, dimostriamo che UnaG è un marcatore superiore per l'infezione da SAFV rispetto a GFP rispetto alla stabilità genomica del genoma del virus. Mostriamo inoltre l'utilità del SAFV che esprime UnaG per lo studio dell'infezione da SAFV e lo screening di farmaci antivirali.